一、所属领域

应用于酰胺类、羧酸类等功能化学品合成；石油开采和水处理等。

二、项目介绍

1. 痛点问题

红球菌是具有高抗逆性（耐有机溶剂、耐高温、耐酸碱）的特殊放线菌，日本30年前首先使用红球菌高效催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺——其聚合产物广泛用于石油开采、水处理、土壤改良剂等领域——迄今为止仍是工业生物技术领域最成功的案例之一。开发红球菌基因编辑方法，一方面可以实现红球菌细胞自身性能的按需调控（如敲除副产物基因），解决丙烯酰胺、丙烯酸铵等酰胺、羧酸类大宗/精细化学品生产中的高成本和高排放问题，另一方面有望以红球菌细胞为普适性宿主，高表达各种外源功能酶，从而实现重组红球菌全细胞催化技术的普遍应用，尤其是解决手性医药中间体现有制备工艺中路线长、工艺复杂、原子经济性差、环境污染严重等各种主要问题。但是，作为一种革兰氏阳性放线菌，红色红球菌存在基因组中GC含量高、基因转化率低、非法重组严重等问题，基因组改造困难。目前红色红球菌基因组改造主要依赖于自杀质粒介导的同源重组，但自杀质粒转化效率和单交换成功率很低，正确编辑率更低。因此，迫切需要开发高效的红球菌基因组编辑工具。

2. 解决方案

本技术核心成果是一种基于CRISPR（成簇规律间隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技术的红色红球菌基因组高效编辑方法。该技术通过红色红球菌特有启动子及质粒元件，首先实现了Cas9蛋白在红色红球菌中的表达及切割功能；其次成功规避了红球菌的限制修饰系统，将红色红球菌基因转化效率提高了80多倍；接下来，又通过红球菌重组酶的引入，显著提高了外源基因在红色红球菌中的同源重组效率，最终率先成功建立红色红球菌的CRISPR/Cas9基因编辑系统，不仅可以实现基因组上目标基因的敲除、替换和改造，也可实现多个基因的同时敲除以及无痕叠加敲除，为红球菌全细胞催化平台技术开发及其在化学品绿色先进制造中的应用奠定了坚实基础。

红色红球菌高效基因组编辑技术及基因元件工具箱

3. 竞争优势分析

本成果克服了红色红球菌GC含量高达70%从而基因操作困难、限制修饰系统强大且未知从而基因编辑困难等多个难点，国际上率先完成了红色红球菌重要基因元件、基因型-表型构效关系等研究，率先成功实现红色红球菌CRISPR-Cas9前沿技术改造，实现了基因敲除、插入、替换和突变等高效编辑。该成果2020年发表在代谢工程领域顶刊Metabolic Engineering上，且已授权中国发明专利。研究表明，其它微生物，如大肠杆菌、浑浊红球菌等体系的CRISPR-Cas9技术不能直接用于红色红球菌。

本成果还构建了性能优异的产酰胺、羧酸类化学品的红球菌全细胞催化剂。尤其是用于丙烯酰胺生产的重组红球菌，近年来已实现逐年升级换代，合作企业已实现利税约10亿元。在此基础上，于2021年进一步实现了腈水合酶活性倍升、红球菌基因开关防盗以及抗逆性显著提升，处于国内外行业领先地位。

4. 市场应用前景

利用本成果高效红球菌基因组编辑方法及本团队创建的红球菌基因元件工具箱，正在开发红球菌全细胞催化剂生产化学品的平台技术。

5. 发展规划

发展全新一代生产丙烯酰胺、烟酰胺等产品的全细胞催化剂，具有高酶活、高抗逆、零副产物特点，可为客户创造显著效益。正在开发的多个高值化学品、手性医药中间体、原料药的绿色生物制造新工艺，也将形成一系列独创的关键技术，产生更大的经济和社会效益。

6. 知识产权情况

本成果已授权中国发明专利1项。

三、合作需求

开展合作开发、技术许可等，寻求有志于生物制药、生物合成、石油开采、日化洗涤等不同应用领域进行红球菌全细胞催化法生产目标产品的企业合作，尤其是在上述不同领域具有生产和销售优势或经验的企业。

四、团队介绍

团队负责人于慧敏，为化学工程系长聘教授，主要从事先进生物制造及纳米生物技术研究，致力于面向工业环境发展高性能生物催化剂构建技术与理论。主持国家重点研发、973、863、国家自然科学基金等课题30余项，在Biotechnology Advances, Metabolic Engineering等学术期刊上发表论文130余篇，出版专著章节5部，申请/授权发明专利40余项。产业化已创利税10亿多元。曾获教育部技术发明二等奖、自然科学二等奖、中石化工联合会技术发明二等奖、青年科技突出贡献奖等。入选教育部新世纪优秀人才、全国百篇优博论文作者、北京市科技新星（A类）。现任Biotechnology Notes 副主编，Biochemical Engineering Journal、《化学与生物工程》编委。中国生化制药工业协会糖类药物分会专家委员、化工学会首届女科工委，亚洲合成生物学联盟成员，Metabolic Engineering Summit 14主席团成员。

五、联系方式

E-mail：ott@tsinghua.edu.cn

成果编号：2021201

注：所有成果发布内容未经授权，请勿转载！

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